高分辨率的空间转录组学技术在mRNA检测中往往缺乏高灵敏度。

2024年1月16日，上海交通大学杨朝勇、吴玲玲、宋佳及郑军华共同通讯在Nature Biotechnology 在线发表题为“Decoder-seq enhances mRNA capture efficiency in spatial RNA sequencing”的研究论文，该研究报道了一种用于空间RNA测序(Decoder-seq)的树状细胞DNA坐标条形码设计，该设计具有高灵敏度和高分辨率。Decoder-seq将树状纳米底物与微流体坐标条形码相结合，生成DNA密度比以前报道的方法高约十倍的空间阵列，同时保持分辨率的灵活性。

该研究发现Decoder-seq的高RNA捕获效率提高了对小鼠嗅球中低表达嗅受体(Olfr)基因的检测，并有助于发现两个Olfr基因的独特层富集模式。Decoder-seq提供的近细胞分辨率使构建小鼠海马的空间单细胞图谱成为可能，揭示了神经元中富含树突的mRNA。在将Decoder-seq应用于人肾细胞癌时，研究人员剖析了不同癌症亚型的异质性肿瘤微环境，并鉴定了与上皮-间质转化相关的空间梯度表达基因，这些基因具有预测肿瘤预后和进展的潜力。

破译细胞的空间组织和分子特征对于理解各种生物和病理生理过程至关重要，如胚胎发生、神经过程和疾病进展。空间分辨转录组学(SRT)技术是描述组织内空间基因表达模式、揭示细胞类型组成、空间排列和相互作用的强大工具。现有的SRT技术包括两种主要方法：基于成像的原位杂交(ISH)或原位测序(ISS)和基于空间条形码阵列的测序。虽然前者提供亚细胞分辨率，但它涉及冗长、重复和技术要求高的成像工作流程。或者，后者使用DNA阵列大规模编码组织mRNA，通过下一代测序可以读出mRNA的类型、丰度和空间位置。基于空间条形码阵列的测序提供了一种高通量，直接的全转录组分析方法，已获得广泛关注。

目前已经开发了几种生成空间条形码DNA阵列的方法，可分为确定性和随机条形码策略。前者通常利用微点法将确定的寡核苷酸沉积在固体基质上的特定位置。然而，仪器的精度限制了斑点的大小，多细胞分辨率，条形码成本随着斑点的数量线性增加。后者使用在底物上随机生成的DNA微球、纳米球或团簇，产生空间条形码DNA阵列，具有从细胞到亚细胞分辨率的较小特征。该策略用于HDST10、Slide-seq/Slide-seqV2、Seq-scope、Stereo-seq和Pixel-seq等技术。随机条形码策略需要耗时和昂贵的测序程序来解码DNA球或簇的位置索引。

Decoder-seq工作流程（图源自Nature Biotechnology ）

基因检测灵敏度是基于空间条形码阵列方法面临的另一个挑战。例如，空间转录组学(ST)的灵敏度为ISH9的6.9%，而Slide-seq的灵敏度为2.7%。这可能导致缺少重要的低丰度转录本，限制了生物学应用的范围。例如，绘制编码嗅觉受体(Olfr)基因的空间表达模式对于理解嗅觉至关重要，但现有的基于空间条形码阵列的方法难以敏感地检测低表达的Olfr转录本。此外，由于转录本的丰度降低，目前的方法检测有价值的RNA降解临床样品中的分子模式的能力有限。DNA条形码阵列的mRNA捕获效率在很大程度上决定了基因检测的灵敏度。然而，现有的底物受到低DNA修饰密度的影响，导致mRNA捕获效率低。

该研究报道了一种用于空间RNA测序(Decoder-seq)的树状细胞DNA坐标条形码设计，以提高检测灵敏度和空间分辨率。首先，与已有的SRT方法相比，三维(3D)纳米衬底提供了大约一个数量级的空间DNA条形码密度增强。与ISS相比，Decoder-seq的RNA捕获效率高达68.9%，可以灵敏地检测低表达的Olfr基因，并鉴定出其他基于空间条形码阵列的SRT方法所缺失的两个Olfr基因的独特层富集模式。其次，受使用x-y坐标系统来定义平面内任何位置的想法和优雅的DBiT-seq设计的启发，采用微流体辅助条形码策略来生成具有灵活性和精度的空间分辨率(50、25、15和10 μm)的x_i - y_j坐标DNA阵列。第三，确定性DNA x_i和y_j的组合条形码减少了DNA条形码的多样性，避免了解码步骤。近细胞分辨率的Decoder-seq检测到每μm²平均转录本计数为40.1个唯一分子标识符(UMIs)。通过结合反卷积和基于图像的细胞分割算法，Decoder-seq实现了与亚细胞分辨率方法相当的小鼠海马的空间单细胞图谱。总之，Decoder-seq在基因检测方面具有很高的灵敏度，并且在3D树突载玻片上具有很高的mRNA捕获效率。

杨朝勇教授团队致力于发展基于微流控的单细胞及空间组学平台，以实现高效率，高灵敏以及低成本的测序研究。上海交通大学医学院博士后曹姣，博士生郑重，博士后孙迪为共同第一作者；杨朝勇教授，吴玲玲副研究员，宋佳副研究员以及仁济泌尿外科郑军华教授为共同通讯作者。 

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41587-023-02086-y