肺癌是世界上第二大常见癌症，晚期患者的5年生存率约为6%。其中，非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的肺癌类型，约占总病例的85%。在NSCLC中，腺癌（LUAD）是最常见的组织学亚型，其次是鳞状细胞癌（LUSC）。

近年来，已有多项研究使用单细胞技术来探索NSCLC的转录变化。但许多研究中，每个患者分析的细胞数量有限，并且通常没有系统地收集患者匹配的非肿瘤组织，从而限制了对肿瘤和邻近非肿瘤组织内生物学异质性的剖析。此外，虽然单细胞转录组测序（scRNA-seq）可以在组织内高分辨率地识别细胞类型及其状态，但仍缺乏精确定位其空间分布或捕获局部细胞-细胞相互作用以及介导这些相互作用的配体和受体的能力。

来自英国Sanger研究所等单位的研究团队在Nature Communications发表了题为“Single-cell and spatial transcriptomics analysis of non-small cell lung cancer”的文章。研究团队将来自25名未接受治疗LUAD或LUSC患者的近90万个细胞的scRNAseq数据和其中8名患者的空间转录组学数据结合起来，系统研究了肿瘤和邻近非肿瘤组织中细胞组织的差异，构建了肺癌免疫和非免疫区图谱，并探讨了肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤环境中经历的分子变化，增强了对其在肿瘤微环境中作用的理解。

文章发表在Nature Communications

01 NSCLC的scRNA-seq和空间图谱

为了确定LUAD和LUSC中免疫和非免疫细胞状态的异质性及其空间分布，研究团队收集了25例LUAD、LUSC或未确定肺癌类型患者的肺组织以及两名健康的已故供体样本，并收集了匹配的正常非致瘤性组织，分离出CD45阳性免疫细胞、肿瘤细胞和其他非免疫群体。此外，研究还使用10x Genomics Visium平台对8例患者的肿瘤和背景组织切片进行空间转录组学处理。

研究鉴定了单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）以及肥大细胞、自然杀伤细胞（NK）细胞、T细胞、B细胞和非免疫细胞亚群。此外，研究还在肿瘤内发现了一个以髓系（LYZ、CD68、CD14、MRC1）和上皮基因（KRT19、EPCAM）共同表达为特征的亚群，这与先前描述的癌症相关巨噬细胞样细胞（CAMLs），CAMLs的丰度与对治疗干预的反应直接相关，这突出了其功能意义。

免疫和非免疫区的组成在肿瘤和对照样本之间存在显著差异。在肿瘤中，研究人员检测到成纤维细胞，淋巴内皮细胞（LECs）的比例减少，单核细胞和未成熟骨髓细胞的比例显著降低，上皮细胞群体表现出更高的多样性，这表明肿瘤转化导致细胞状态的进一步多样性。总之，与邻近肺组织相比，肿瘤表现出更高的免疫和非免疫细胞多样性。

图1. scRNA-seq揭示NSCLC的异质性

02 LUAD和LUSC利用不同的细胞-细胞相互作用网络

LUAD和LUSC的预后非常不同，为了研究临床特征的差异是否源于不同的细胞组成，研究团队比较了LUAD和LUSC患者中免疫和非免疫细胞亚群的频率。在患者中观察到的免疫细胞和非免疫细胞的频率与癌症亚型、癌症分期或性别之间没有明显的关联，表明LUAD和LUSC中的肿瘤微环境组成相似，研究观察到的临床差异可能源于不同的细胞间相互作用。因此，研究分析了LUAD和LUSC在肿瘤微环境中是否使用了不同的细胞-细胞相互作用网络。结果发现，几对免疫检查点抑制剂（ICI）及其各自的抑制分子在LUAD和LUSC中存在差异共表达。

此外，对于在LUAD和LUSC中检测到的重要受-配体对（L-R），在不同的骨髓细胞群体中，有几对参与血管生成信号传导。例如，虽然VEGFA和VEGFB在LUAD和LUSC中均有表达，但它们的受体在LUAD中更常见，尤其是在成纤维细胞中。

图2. 整合的单细胞和空间转录组学揭示了LUAD和LUSC拥有不同的细胞-细胞相互作用网络

03 整合验证L-Rs在原位的相互作用

基于scRNA-seq数据集中不同细胞类型的基因共表达，研究人员计算了显著L-Rs及其相互作用的细胞类型。然而，为了辨别生物学上重要的相互作用，有必要确定相互作用的细胞类型是否确实在物理上是共存的。为了证实这一点，研究团队采用了一种综合方法，将肿瘤和对照样本的scRNA-seq与新鲜冷冻肿瘤和背景组织切片的空间转录组学图谱结合起来，发现肿瘤与对照样本中细胞类型频率的差异与scRNA-seq数据中获得的结果一致。

在L-Rs的空间共定位分析中。如果两个基因在同一位点上表达，并且在整个切片点上给定基因的中值以上，则认为L-Rs是共定位的，研究比较分析了匹配肿瘤与对照切片中L-Rs基因共定位与非共定位的频率，进一步证实了肿瘤特异性L-Rs在肿瘤中的共定位明显多于背景切片，包括NRP1-VEGFA、NECTIN2-TIGIT和LGALS9-HAVCR2等。

图3. 空间转录组学分析证实关键受配体对的空间共定位

04 肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤内胆固醇和铁外排

为了更好地了解不同巨噬细胞群体在肿瘤微环境中经历的转录变化，研究团队进行了差异表达分析。与对照样本相比，肺泡巨噬细胞（AM）和抗炎巨噬细胞（AIM）都上调了参与胆固醇和脂质转运和代谢的基因，胆固醇在肿瘤生长中起着至关重要的作用。研究检测到胆固醇输出基因ABCA1在AM和AIM中有较高的表达，低密度脂蛋白受体（LDLR）则没有表达，表明胆固醇优先从肿瘤相关巨噬细胞向肿瘤微环境输出，后续实验也证实了肿瘤微环境中脂质的增加，这可能是由于肿瘤相关巨噬细胞输出增加的结果。

此外，研究人员还在肿瘤组织中发现了STAB1+巨噬细胞亚群，并鉴定了20个“STAB1特征基因”。有趣的是，STAB1+巨噬细胞亚群特异性表达SLC40A1，其编码铁转运蛋白，铁转运蛋白是唯一已知的从细胞质中穿过质膜输出铁的蛋白，是巨噬细胞释放铁活性的关键。因此肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境内经历“重编程”，并促进胆固醇外排和铁输出，从而支持了肿瘤进展。更加有意思的是，研究还发现肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境的“驯化”下，获得类似于胎儿巨噬细胞的转录特征。

图4. 肿瘤相关巨噬细胞经历癌胚重编程。

05 结语

该研究利用细胞和空间转录组学分析了来自25名未经治疗的NSCLC患者大约90万个细胞，构建肺癌免疫和非免疫区图谱。虽然研究在腺癌和鳞状细胞癌中观察到相似的细胞类型组成，但也发现关键的受配体对存在显著差异。此外，研究还揭示了肿瘤中巨噬细胞转录的“重编程”，即肿瘤相关巨噬细胞向肿瘤微环境的胆固醇输出增加，并采用类似胎儿的转录特征来促进铁外排。总之，这一多组学资源提供了NSCLC的高分辨率分子图谱，增强了人们对NSCLC的理解，对未来研究NSCLC发病机制以及开发特异性靶向治疗药物具有重要意义。

论文原文：

De Zuani, M., Xue, H., Park, J.S. et al. Single-cell and spatial transcriptomics analysis of non-small cell lung cancer. Nat Commun 15, 4388 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-48700-8.