早发性卵巢功能不全（POI）是女性40岁之前出现的卵巢功能衰退或丧失，严重影响女性身心健康和生育功能，目前临床尚无法提供治愈方法。间充质干细胞（MSCs）来源广泛，具有再生、增殖及修复受损组织的本领，在 POI治疗领域具有广阔应用前景。但MSCs的推广应用仍面临难题，如进入体内后存活率低、旁分泌及分化能力受损、活细胞包装及运输的局限性、临床应用存在致瘤或诱发免疫反应等。因此，探索不同形式的MSCs优化策略以解决上述难题成为当前研究热点。本文总结了当前MSCs治疗POI的研究进展，综述了近年来MSCs治疗POI的优化策略，以期进一步为POI的治疗提供参考依据。

早发性卵巢功能不全(POI)是指女性40岁之前出现卵巢活动衰退的临床综合征，表现为月经紊乱、促性腺激素升高、雌激素下降等，可导致不孕。目前临床主要使用激素替代治疗(HRT)以改善POI患者的临床症状，但长期使用该治疗方法会增加乳腺癌、子宫内膜癌、心血管疾病的发生风险，并且停药后患者围绝经期的症状容易再次出现，同时该种方法无法修复患者自身卵巢功能。

间充质干细胞(MSCs)是一种具有低免疫原性、高分化能力和旁分泌特性的多能干细胞，可从骨髓、胎盘、脂肪、脐带及羊水、月经血等间质组织中提取而来。目前，MSCs被广泛用于治疗血液、神经、运动、心血管和皮肤等多种不同系统疾病，并显示出良好的疗效。

MSCs治疗生殖系统疾病的有效性同样被临床前和临床研究证实。其中，多种来源的MSCs均能不同程度地促使POI动物模型恢复动情周期、提高生殖激素水平、增加各级卵泡数目、改善生育能力。研究发现，MSCs进入受损卵巢组织后可发生定向分化，还可通过外泌体传递关键的细胞因子，发挥促增殖、抗凋亡、抗纤维化、抗炎、调节免疫、抗氧化、促进血管生成和调节自噬等作用，从而改善卵巢功能。

随着干细胞研究的发展，MSCs成为从根本上恢复POI患者生育能力的一种潜在治疗手段，通过增加不同发育阶段的卵泡数，改善POI患者卵巢内分泌功能并促使月经恢复，帮助患者获得良好妊娠结局，展现出广泛的应用前景。

然而，作为细胞治疗，MSCs仍然存在一些不容忽视的缺陷限制了其广泛的应用，主要分为两个方面：

（1）有效细胞量：有研究表明， MSCs进入体内后会在趋化因子的作用下迁移至受损组织发挥治疗作用，这提示受损组织周围有效细胞量是决定疗效的关键。然而组织受损后体内微环境出现的炎症、氧化应激、缺氧反应会使植入后的MSCs迁移特性、细胞活性、旁分泌及分化能力等生理特性发生改变，直接影响受损组织周围有效细胞量，从而影响干细胞参与组织再生和修复过程。

（2）相关弊端：MSCs治疗也面临着细胞治疗的诸多弊端，如移植MSCs后同种异体抗体产生及诱发自身免疫性疾病、诱导肿瘤发生或进展、MSCs包装和运输方面具有更为严格的要求、制备质量不可控制等。因此，如何提高干细胞在体内微环境中的耐受力，以及其对人体治疗的安全性，进一步优化MSCs治疗技术，是当前领域亟待解决的关键问题。

本文在总结MSCs治疗POI相关研究的基础上，阐述了一系列优化策略，以期为POI治疗的深入研究和临床转化提供更多方向。

一、MSCs的预处理策略

为了应对干细胞移植后的恶劣微环境，医学研究领域提出了“细胞预处理”概念，即通过提前适应恶劣坏境或放大特定的有益细胞信号通路来提高给药细胞的治疗效果和再生能力。目前已有多种细胞预处理方法，例如应激预处理、生物药物预处理等。

1.应激预处理策略：

研究表明，当细胞处于应激之下，为适应应激环境，细胞会激活促进存活的相关信号通路以增强其增殖潜能和旁分泌能力。因此，在MSCs移植前提前进行应激预处理，能够增强MSCs在体内的迁移、增殖和存活率。常见应激预处理方法包括以下4种：

（1）热休克：指将细胞放入高温水浴处理，处理时间无统一标准，常用的处理方法是42℃水浴处理30 min到3 h不等。Wang等将42℃水浴预处理1 h后的MSCs移植入POI小鼠卵巢内发现，相较于未预处理组，预处理组动情周期的恢复及性激素水平改善更为明显，卵巢重量及各级卵泡数也相应增加；此外，该研究还认为热休克蛋白表达升高以及自噬减弱也可能是热休克预处理预防细胞凋亡和提高MSCs存活率的机制之一。

（2）低强度脉冲超声(LIPUS)：一种低强度和低热效应的脉冲式发射的超声波。Ling等的动物研究发现，与未预处理组相比， LIPUS预处理后MSCs的移植在修复化疗诱导的卵巢损伤、缓解卵巢组织炎症、改善局部微环境和抑制化疗诱导的颗粒细胞凋亡等方面表现出更大的优势。有研究认为，LIPUS可能通过上调CyclinD3和c-myc基因以激活MAPK/ERK和PI1K/Akt信号通路，从而促进MSCs增殖的潜在机制。

（3）低氧：短期低氧预处理后MSCs的治疗作用并不会被减弱，反而会活化一些利于其适应低氧环境的信号通路，从而改善其增殖、迁移、炎性、旁分泌、免疫性能等生物学特性。缺氧应激会增加缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达，从而上调一些在细胞迁移、活力、新生血管形成、分化和增殖中起关键作用的下游靶标和信号分子。例如，HIF-1α能够上调磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号传导，从而提高细胞存活率。

实验证明，低氧环境可增强人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)的增殖能力和相关生长因子的表达，但仍保持着与常氧环境下培养的脐带间充质干细胞(UCMSCs)相似的表型、分化能力以及淋巴细胞增殖抑制能力。赵越等对UCMSCs进行了低氧预处理，将70%~80%融合的MSCs放入1%O2连续培养48 h，结果显示小鼠的生长卵泡和闭锁卵泡数量更趋于正常。

2.生物药物预处理：

MSCs可与体内存在的许多生物分子和介质相互作用，从而影响其疗效。体内存在的几乎所有分子都可能会影响移植细胞的再生能力，其中部分生物分子具有积极影响。因此，在移植MSCs前预先加入利于细胞的生物分子作为诱导剂，能够提高MSCs的存活能力及旁分泌功能。

常见预处理诱导剂包括过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)等生物代谢物，白细胞介素(IL)、干扰素γ (IFN-γ) 和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)等细胞因子，神经胶质衍生神经营养因子(GDNF)等生长相关介质，以及其他生物分子，如脂多糖(LPS)和热休克蛋白(HSP)。

研究表明，用炎性介质IFN-γ、TNF-α和IL-17预处理MSCs可提高其免疫调节能力，从而增加其对自身免疫性疾病的治疗潜力。此外，药物预处理可通过上调与生长因子分泌、抗氧化活性、迁移、趋化因子/细胞因子受体、线粒体能量和应激反应信号通路相关的基因来提高MSCs的治疗作用。

Huang等发现，作为MSCs体外培养的添加剂，褪黑素可以促进脂肪间充质干细胞(ADSCs)的增殖及分泌功能，进而增强ADSCs在恢复POI小鼠激素水平、平均原始卵泡计数和生殖能力等方面的作用，其作用机制可能与SIRT6/NF-κB通路激活相关。Wang等同样发现，MSCs移植前联合人脐带血富血小板血浆可提高MSCs存活率并增加归巢至受损卵巢组织的有效MSCs细胞数量，从而更有效地促进MSCs改善卵巢内分泌功能和促进卵泡发育的作用。

二、递送MSCs的复合生物材料

近年来，生物材料的高速发展为解决MSCs应用中的再生问题带来了希望，在卵巢衰老相关的治疗中表现出独特优势，例如促进有利的细胞相互作用、相对较高的载药量、可控的药物释放、优异的被动和主动靶向、体内低毒性和可生物降解性、良好的稳定性和生物相容性。因此多种生物材料被用作MSCs的生物相容性细胞支架，为细胞提供机械支持，以提高移植干细胞的存活率、保留性、靶向性和旁分泌生物因子等能力。常见的用于干细胞递送系统搭建的生物材料包括胶原蛋白、透明质酸和海藻酸盐等，具体通途和作用详见总结表1。

三、MSCs的无细胞治疗策略

与活细胞治疗相比，无细胞治疗方式具有多种优势，例如减少宿主免疫应答、致瘤性发生率，易储存性使其更适于大规模生产等。此外，近年来认为卵巢功能的改善主要是由于MSCs旁分泌的细胞因子和生长因子刺激损伤部位的细胞进行修复，而非直接分化为生殖细胞，因此研究逐渐向干细胞衍生产物的方向深入，如含有干细胞分泌蛋白、细胞因子等的干细胞条件培养基、细胞外囊泡以及线粒体等，即无细胞治疗方式。MSCs相关的无细胞治疗在POI体外及动物模型中恢复卵巢功能及生殖能力的作用被充分证实，为POI的治疗提供了新的思路和策略。

1.MSCs衍生条件培养基（MSC-CM）：

主要成分为干细胞的分泌组、微囊泡和外泌体等。有研究对干细胞分泌组进行了蛋白质检测，发现了许多生长因子和其他细胞因子，如血管内皮衍生生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子I和II、肝细胞生长因子、白细胞介素等炎症调节因子，以及粒细胞集落刺激因子等。研究表明，MSC-CM治疗的抗氧化能力与直接使用MSCs相似，却具有更好的安全性及重复性，更易保存和运输，免疫原性更低，并且不存在干细胞潜在的致瘤副作用。

基于上述优势，许多研究将MSC-CM用于治疗POI，证实了其对POI小鼠卵巢储备和生育能力的保护作用。2020年，Hong等发现向POI小鼠腹腔注射人MSC-CM，不仅能够促进发情周期的恢复，缓解卵巢损伤导致的卵泡耗竭，而且还能抑制卵母细胞和颗粒细胞的凋亡；对整组卵巢进行RNA测序分析发现，POI对照组和MSC-CM处理后卵巢的差异表达基因主要为参与细胞凋亡的基因。有研究发现MSCs来源不同，其分泌组的成分也存在差异，这提示其治疗作用也可能存在一定差异。例如在辅助生殖领域，相较于ADSCs的条件培养基，人羊膜间充质干细胞的条件培养基更能提高小鼠胚胎的抗氧化能力。

2.MSCs的细胞外囊泡：

研究表明，细胞在受到物理或化学刺激时会释放一类具有膜性囊泡样结构的纳米级物质，即细胞外囊泡（EVs），并将来源于母细胞的RNA和蛋白质等物质定向转移至靶细胞，或作为信号分子直接刺激靶细胞使受体细胞的表型和功能发生改变。

根据囊泡大小可分为两大类，即外泌体（exosomes）和微囊泡（MVs）。其中，外泌体是细胞外囊泡的主要亚群之一，具有脂质双分子膜结构，其内富含蛋白质、DNA和许多小的非编码RNA，如microRNA、小核仁RNA、YRNA、线粒体RNA、lncRNA等，其中miRNA成分在靶细胞中起主要作用。

越来越多研究认为，EVs尤其是外泌体及其包含的miRNA，是MSCs分泌组中最有效的生物成分，人们普遍认为外泌体及miRNA可以调控下游靶基因的表达，参与卵巢细胞的增殖、分化和凋亡，改善激素代谢，减少氧化应激和抗炎作用，从而达到治疗POI 的目的。例如，Ding等由此发现羊膜间充质干细胞来源的外泌体通过miR-320a靶向抑制SIRT4从而抑制卵巢细胞凋亡；Park等的研究指出，EVs疗效呈剂量依赖性——与匹配剂量的MSCs治疗相比，静脉移植EVs疗效的持续时间更短，然而通过增加注射剂量或注射次数能够将疗效提高到与MSC治疗相似水平。

总之，EVs因其能够避免活细胞治疗弊端，且具有相似的治疗效果，在POI治疗领域的潜力被不断挖掘，未来将成为POI 治疗领域提供新的方向和策略。表2总结了不同来源EVs治疗POI的主要治疗效果和机制。

 

3.MSCs的线粒体：

线粒体作为细胞中重要的能量工厂，除了产生生命活动所必需的腺嘌呤核苷三磷酸外，还调节细胞凋亡，因此常认为其功能减退伴随衰老的发生。无论是POI患者亦或自然衰老妇女，其卵母细胞及颗粒细胞中的线粒体功能和能量代谢都有不同程度的衰减，表明POI可能与线粒体功能异常有关。目前临床上广泛应用的辅酶Q10药物(线粒体氧化呼吸链中重要成分)正是通过提高线粒体功能来改善卵巢功能的。

研究表明，MSCs可通过不同模式将其自身的正常线粒体转移到周围线粒体受损的靶细胞，如心肌细胞、肺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞等，以产生特定功能活性。研究认为，干细胞的线粒体特征与卵母细胞相似，具有更少的潜在突变和mtDNA缺失的组织特异性自体线粒体，被认为是自体线粒体转移的理想来源。由此，采用MSCs衍生线粒体疗法，可增加卵母细胞中线粒体的数目或功能，进而部分恢复衰老卵母细胞的活力。

一项对诱导多能干细胞(iPS)衍生线粒体转移的研究表明，iPS线粒体的形态特征和膜电位与卵母细胞相似，挽救了衰老雌性小鼠胚胎的发育潜力，并提高了胚胎移植着床率。Morimoto等选取52名因胚胎质量差而反复助孕失败的患者，自体培养MSCs后提取其线粒体，与精子同时注入成熟卵母细胞内，提示能够提高胚胎质量和助孕成功率，且不影响后代的认知和运动功能，同时暂未发现子代mtDNA异质性问题。

尽管线粒体疗法在再生医学中显现出巨大潜力，但目前仍处于非常前期的阶段，存在如线粒体的分离方式、剂量、递送方法等尚无质量控制的统一标准、外源性线粒体作用机制不明确等多方面技术问题，有待更多临床实验深入研究。

四、总结及展望

MSCs来源广、取材方便，通过良好的增殖分化和旁分泌功能发挥组织修复及免疫调节等能力，近年来在生殖系统疾病领域掀起了研究热潮，同时被认为在POI治疗领域中具有临床转化可行性和广阔应用前景。

为了解决MSCs应用中的问题从而更好地发挥MSCs的治疗作用，越来越多基于MSCs治疗POI的优化策略被提出，包括：一系列MSCs移植前预处理策略提高移植细胞对恶劣环境的耐受性及其治疗潜力；与具有良好的生物相容性和易降解性生物材料的结合提高了MSCs递送效率和细胞活性；MSCs的不同无细胞治疗策略有效避免细胞治疗带来的风险。

然而，目前对于MSCs治疗POI的研究还处于前期阶段，仍然存在诸多问题需要解决：

（1）不同MSCs来源以及MSCs衍生物选择、移植时机、途径、频率及总量、给药前最优预处理策略、结合生物材料的选择等作为影响疗效的重要因素，当前尚无明确应用标准，有待进一步探究最佳应用方案；

（2）MSCs及其衍生物（如外泌体等），分离方法各异，不同提取方法获得的产量和纯度具有异质性，如何提高产量和效力、增加其可重复性，使其高效准确地定位至靶组织和靶细胞发挥作用，以获得更佳的治疗效益，仍是未来关注的重点；

（3）当前已对MSCs治疗POI的作用机制有一定研究基础——可能与MSCs“归巢”作用、分泌细胞因子参与卵泡发育和排卵过程、免疫调节和抗炎作用、减少氧化应激、卵巢血管生成调节、抗细胞凋亡、线粒体转移、自噬调节等有关，但具体作用机制尚不明确，未来仍须深入探究MSCs治疗POI过程中参与的信号通路及相关机制；

（4）安全性始终是MSCs临床应用研究的重中之重，不管是MSCs治疗亦或是MSCs衍生的无细胞治疗，在临床转化前仍需要更多研究全面评价其安全性。值得注意的是，改善POI患者生育能力是疗效评价中的关键，这意味在安全性的评价中不仅要评估受试者的情况同时还应囊括对其子代的近远期影响。

总之，未来亟待更多MSCs应用的安全性和有效性研究，同时我们相信随着科学研究的不断进步，MSCs将为更多POI患者的治疗带来希望。

文章来源：

范沛吟，张佳丽，徐键，等.基于间充质干细胞治疗早发性卵巢功能不全优化策略的研究进展[J].生殖医学杂志，2024,33(4):546-552.