循环肿瘤DNA

液体活检，特别是循环肿瘤DNA(ctDNA)，作为一种无创或微创检测方法，已在肿瘤的临床应用中引起广泛关注。由于相对较高的ctDNA浓度及肿瘤特异性遗传学和表观遗传学异常的高负荷，许多血液系统恶性肿瘤非常适合连续和重复的ctDNA监测。近年来检测技术的进步也显著提高了灵敏度和特异性，从而扩大和加强了ctDNA的潜在用途，包括早期诊断、预后和耐药评估、治疗反应评估、微小残留病(MRD)监测、靶向治疗选择和免疫治疗监测。

除了ctDNA，对于血液系统恶性肿瘤，游离DNA(cfDNA)中肿瘤特异性畸变首次在骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)患者中发现，数字聚合酶链式反应(ddPCR)、二代测序(NGS)和DNA甲基化监测等新技术的出现和进步，也有助于ctDNA研究发生革命性的变化。

《Blood Reviews》近日发表文章，就ctDNA在血液系统恶性肿瘤（特别是淋巴瘤、骨髓瘤和白血病）中的特点、技术、临床应用及未来应用进行综述，通讯作者为华中科技大学同济医学院附属协和医院孙春艳教授和李俊颖教授。

1.ctDNA的介绍

1.1. ctDNA的起源和特征

游离DNA(cfDNA)是一种自由漂浮、短而裸露的单链或双链核酸，在细胞凋亡、坏死或主动分泌时进入循环，由身体组织释放的各种片段化 DNA 分子组成。双链cfDNA的末端可以为钝端，也可以是锯齿状末端。末端序列具有高比例的某些基序，如2-核苷酸寡聚体(2-mer)或4-mer基序。通过深度测序对 cfDNA进行末端分析，可以比较来自不同组织的DNA分子。片段化并非随机过程，因为某些基因组区域更有可能被切割并在末端发现，称为“首选末端位点”。但其中涉及的机制仍有待探索。

由于癌症患者的cfDNA水平高于健康人，CfDNA可用于估计总体肿瘤负荷。但循环DNA的释放可归因于健康细胞、恶性细胞和肿瘤微环境细胞，导致其敏感性和特异性不够。而作为cfDNA的一部分，ctDNA特异性地来源于肿瘤和肿瘤相关细胞。需要注意的是，ctDNA并非来源于循环肿瘤细胞(CTC，液体活检的另一种生物来源)。ctDNA仅占总cfDNA的一小部分，根据肿瘤类型、肿瘤负荷、疾病分期和治疗干预措施的不同，该比例从不到0.1%到10%不等，有时甚至更高。

ctDNA的半衰期为1至2小时，循环DNA具有已知的大小谱。健康人的cfDNA具有167 bp的显著模态大小，而ctDNA显示约143 bp的模态大小，因此选择这些片段(大小在90至150 bp之间)可以提供中位数两倍的ctDNA富集。但哪种片段大小最具信息量的问题仍然没有达成共识，对于为什么ctDNA更短，也没有确定的生物学解释。一项将多种类型肿瘤患者与健康对照进行比较的研究表明，癌症患者的cfDNA短片段(100- 150bp)与长片段(151- 220bp)的比例更低，并且大小差异较大。另一项针对肿瘤cfDNA的研究显示，长度超过253 bp的片段比例在1.12%至40.90%之间，证实长片段在个体间的巨大差异。Markus H.等人发现ctDNA可以富集成比单核小体(~167bp)短的片段及比二核小体(~240-330bp)更短的片段。

CtDNA是一种与不同类型肿瘤和组织高度相关且特异性的动态生物标志物，其在循环中的水平可反映肿瘤负荷以及其在恶性细胞中的释放和清除速率。ctDNA所携带的肿瘤特异性异常，如片段差异、点突变、阶段性变异、拷贝数改变、插入/缺失、易位、免疫球蛋白序列和甲基化位点等，使其在肿瘤学中具有重要价值。

1.2. ctDNA检测的技术

1.2.1.标本来源

理论上，包括外周血、脑脊液(CSF)、胸水、腹水、唾液、尿液、粪便和精液在内的体液都可以作为液体活检的来源，其中血液为首选，也是应用最广泛的。由于血清样本中可能含有凝血过程中白细胞溶解产生的额外物质，这些物质可能会稀释ctDNA的含量，因此血浆是理想的分析物，并被用于最近发表的大多数ctDNA研究。

1.2.2.样本采集和处理

对于影响ctDNA分析质量的样品处理、储存、提取和定量的整个流程，目前仍缺乏标准化，部分实验室无法从验证的样品中获得cfDNA。因此，研究者应在参考相关文献的基础上，严格按照标准化的流程进行研究，以确保最佳的样本质量。

目前还没有一种ctDNA检测方法适合所有目的，不同的检测方法需要不同数量的ctDNA。许多分析前变量都可能影响ctDNA的数量，从而影响最终结果的准确性和可重复性。血浆的采集和处理应根据所关注的科学问题或需要解决的临床问题精心设计，样品处理也应始终遵循经过验证的标准操作程序(SOP)。

ctDNA的释放可能受到患者生理状况、炎症、急慢性疾病等特征的影响，此外化疗、靶向治疗、免疫治疗/免疫化疗、造血干细胞移植(HSCT)和放疗等治疗亦可影响ctDNA水平，因此需要谨慎安排血浆采集的时间和精心设计的样本量。一般来说，至少需要20ml的外周血才能获得足够的血浆 DNA进行分析，但不同的检测方法中可能有所不同。因为有时20ml很难获得，且随着更敏感的方法的出现，现在可能不需要这么多。

采集外周血后，如果使用常规EDTA管(避免使用肝素作为抗凝剂，以免干扰后续PCR)，应在6小时内提取ctDNA，以防止白细胞溶解并将细胞基因组DNA释放到血浆成分中。细胞保存管(即 Streck BCT和CellSave管)可防止细胞破裂，并允许持续稳定的ctDNA储存48小时或更长时间。尽可能减少储存温度的变化应。此外，为了去除血浆制剂中污染的白细胞，首选double-spinning法处理血液。

1.2.3. ctDNA分析

目前ctDNA的检测手段主要有数字PCR(dPCR)和NGS，其中后者应与专门的生物信息学分析相结合。最近引入了更多创新技术，如基于纳米材料的检测方法，在ctDNA检测中显示出高灵敏度。此外正在探索人工智能(AI)和机器学习技术，以实现更准确、更高效的ctDNA分析。

值得注意的是，相对较短的片段长度和DNA甲基化模式有助于区分ctDNA和其他cfDNA；此外，肿瘤特异性突变、拷贝数变异和其他改变也被用于区分。

dPCR方法最初报道于1999年，为一种通过单分子分离、扩增和检测在众多野生型等位基因的背景中鉴定稀有突变等位基因的方法，将PCR的指数、模拟性质转化为线性、数字信号。第一种高通量数字PCR方法称为BEAMing(小珠[beads]、乳浊液[emulsions]、扩增[amplification]和磁性[magnetics])，并成功用于检测和定量ctDNA。随后，ddPCR作为一种新的敏感技术出现，可在标准研究实验室使用的技术平台上更均匀地划分DNA分子，随后许多研究证明了ctDNA的分析和临床有效性。然而所有的dPCR平台都只能通过分子探针检测和分析特定的突变，即有限的突变数量。在以相对公正的方式识别基因改变时，NGS可以提供更深入、更广泛的分析。DNA条形码(每个DNA片段标记有唯一标识符)的出现有助于区分伪产物和真正的突变，从而减少测序错误，从而实现ctDNA的超灵敏检测。PhasED-Seq (Phased variant enrichment and detection sequencing，阶段性变异富集及检测测序)是一种跟踪个体DNA片段中多个体细胞改变的新技术，可降低背景信号并提高检测灵敏度，有助于扩大ctDNA监测MRD的用途。在生成原始测序数据后，使用正确和合适的生物信息学算法和工具对结果进行适当的解释也至关重要。血液学恶性肿瘤中ctDNA的主要采样来源和当前检测技术总结于图2和表1。

2. ctDNA检测在血液恶性肿瘤中的应用

ctDNA检测在血液学恶性肿瘤中的应用正在以多种方式进行探索，图3为ctDNA在疾病进展期间潜在价值的概述。下文分别总结在淋巴瘤、骨髓瘤、白血病和其他疾病中的尝试和结果。

2.1.淋巴瘤

淋巴瘤是具有巨大遗传多样性和空间异质性的异质性肿瘤，且治疗后或随着时间的推移，克隆选择/演化可导致不同的临床结局。单一的组织活检可能无法完全反映疾病生物学的整体特征，依赖医学影像学的治疗反应评估也无法在分子水平检测疾病。理论上，无创ctDNA检测可包括从所有疾病部位脱落的分子，从而克服影像学扫描和组织活检的局限性。此外，淋巴瘤中相对较高的ctDNA浓度和较高的体细胞突变负荷使ctDNA成为一种潜在的新型生物标志物，非常适合于患者管理和临床决策。

ctDNA在淋巴瘤中的众多应用场景可分为两大类：定性评估/基因分型和定量/监测。随着疾病的诊断、治疗、监测和进展，ctDNA基因分型可以提供分子分型、中枢神经系统(CNS)受累、耐药机制、组织学转化、克隆进化和CNS复发的信息；而ctDNA定量与监测在肿瘤负荷量化、疗效评价、预后预测、MRD监测和复发检测等方面均有应用。

ctDNA在淋巴瘤的作用已在多项研究中探索，特别是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和霍奇金淋巴瘤(HL)中。虽然检测方法和关注的淋巴瘤特异性靶点多种多样，但这些研究已经为ctDNA的进一步研究和临床应用奠定良好基础。

2.1.1. DLBCL

诊断时DLBCL的分子分类主要通过组织活检确定。然而，目前的ctDNA基因分型已证明与配对活检高度一致，无论是用于追踪单核苷酸变异(SNV)还是染色体易位。存在于ctDNA中的突变可预测惰性淋巴瘤向DLBCL的潜在组织学转化，在临床识别之前就可以发现。通过基因分型确定的某些基因亚型也可用于帮助识别对某些靶向治疗(例如伊布替尼)敏感的患者，但还需要更多数据来影响常规临床治疗。

除分类外，预处理ctDNA水平还可预测无进展生存期(PFS)、无事件生存期(EFS)和总生存期(OS)。通过免疫球蛋白受体基因序列估计的ctDNA基线水平与与肿瘤负荷相关的某些变量具有高度一致性，包括治疗前血清乳酸脱氢酶(LDH)和β2微球蛋白、疾病晚期、国际预后指数(IPI)评分和通过FDG PET/CT测量的肿瘤总代谢体积(TMTV)。在一项使用深度测序(CAPP-seq)对DLBCL治疗期间的肿瘤个性化分析进行的大型详细研究中，多因素分析显示，与其他常用因素(如分子细胞起源[COO]、IPI评分和TMTV)相比， ctDNA基线水平可更好地预测EFS。最近一项针对新诊断DLBCL患者使用靶向NGS对475个相关基因panel进行CSF-ctDNA谱分析的研究表明，通过ctDNA检测的阳性率远高于传统方法，诊断时CSF-ctDNA阳性与不良预后显著相关，预测CNS复发的敏感性为100%，特异性为77.3%。

疗效评估方面，一个疗程后ctDNA水平降低2个对数(“早期分子学反应”)和两个疗程后降低2.5个对数(“主要分子学反应”)与最佳反应和PFS改善有关。其在CAR-T治疗中的应用也在考虑之中，研究表明，输注后一周cfDNA测序确定的分子学反应与临床反应有显著相关性。在另一项研究中，使用基于捕获的二代测序检测接受CD19 CAR-T细胞治疗的复发或难治性大B细胞淋巴瘤(r/r LBCL)患者的ctDNA，输注前较高水平的 ctDNA和较短的ctDNA片段(<170碱基对)与较差的PFS和OS相关。此外，输注后第14天和第28天ctDNA检测不到的患者，其3个月完全缓解(CR)率、1年PFS和OS均优于检测到的患者。迄今为止，许多已发表或正在进行的研究报道了ctDNA检测用于CAR-T治疗后B细胞非霍奇金淋巴瘤(主要为r/r DLBCL)的预后评估、反应评估和监测，证明了其在未来更准确评估和作为决策工具的潜在作用。

治疗后ctDNA的连续监测也可以为识别无症状复发、获得性耐药和克隆演化提供信息。在接受基于NGS的MRD监测的HSCT后淋巴瘤患者(大多数为DLBCL)队列中，检测到的ctDNA与疾病复发/进展的风险增加有关。但如果要在分子水平上定义患者的缓解，尤其是影像学完全缓解的患者，还需要更精确的数据和更先进的检测技术。在复发前通过液体活检早期检测DLBCL是否可以转化为改善的临床结局，也需要进一步证明。

2.1.2. HL

尽管HL活检中恶性细胞罕见，但Hodgkin/Reed-Sternberg (HRS)细胞的频繁再生和多倍性使得无创分子学技术的应用成为可能。研究表明，晚期HL患者的ctDNA升高水平与其他侵袭性淋巴瘤相当。

基于靶向基因panel，ctDNA基因分型有助于鉴别活检证实的的的肿瘤突变。新兴研究已证明ctDNA基因分型在HL中的可行性，并发现类似的复发突变基因，如STAT6、GNA13、ITPKB、 SOCS1和TNFAIP3。通过对活检样本中的HRS细胞进行金标准荧光原位杂交(FISH)检测，cfDNA基因组谱分析可以准确发现HL中典型的基因组失衡，包括染色体2p和9p的获得。进一步的研究应检验其在疾病筛查和预测治疗反应方面的效用。

与DLBCL一样，经典型HL(cHL)的ctDNA水平也与放射学肿瘤体积相关。即使对于复发/难治性(r/r) cHL，在中期PET评估时无法检测到ctDNA也显示出与PET一致的结果。此外，将基线ctDNA定量与中期PET相结合有助于提高临床结局的预测意义。

对反应评估的精确解释表明，两个化疗周期后ctDNA水平降低超过100倍或2-log可预测HL患者的CR和进一步治愈，而两个化疗周期后降低低于2-log与疾病进展显著相关。

2.1.3.其他淋巴瘤

套细胞淋巴瘤(MCL)患者的ctDNA水平明显高于健康人。通过鉴定和定量血清中含有免疫球蛋白受体序列的ctDNA来监测MRD，与ctDNA可检测的MCL患者相比，经过两个诱导治疗疗程后，ctDNA检测不到的 MCL患者的PFS和OS更长。在AIM研究进行的一项前瞻性分析中，系列监测表明，SWI-SNF突变介导MCL患者对伊布替尼联合维奈托克的耐药。此外，某些设计的基因检测可用于区分传统和白血病非淋巴结型MCL，并有助于预测预后。

血浆免疫球蛋白测序也可揭示滤泡性淋巴瘤(FL)亚克隆之间的异质性和多样性，多因素分析表明，高 ctDNA浓度是与PFS相关的独立因素。在一项用靶向深度测序检测ctDNA的FL患者队列中，与24个月无进展的患者(POD24阴性)相比，无CR或疾病进展少于24个月（POD24）的患者在基线时的ctDNA水平更高。连续监测分析发现，治疗后ctDNA水平急剧下降，在CR和POD24阴性患者中更为明显。通过追踪接受伊布替尼联合O药治疗的复发性FL患者的基线变异，发现ctDNA中的TP53突变可预测治疗失败。CAR-T治疗后通过特异性可追踪突变对ctDNA进行个性化监测也显示出与应答的相关性。

此外，近年来ctDNA在边缘区淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤和T细胞淋巴瘤中的相关研究不断涌现，为ctDNA作为一种有前景的治疗指导和决策方法在未来的应用提供了大量证据。表2总结了近3年来ctDNA在淋巴瘤领域的大量研究。

2.2.多发性骨髓瘤(MM)

MM患者的ctDNA浓度高于晚期实体瘤，从而证实了 ctDNA测序的实用性，其灵敏度令人满意。鉴于MM具有高度的时空异质性，一次性从单个部位侵入性地提取骨髓不足以进行全面的疾病评估，因此ctDNA检测逐渐在MM中得到广泛应用，包括评估肿瘤负荷、检测分子异常、监测反应和监测进展。此外MM CTC的液体活检在疾病监测中也显示出良好应用前景。

MM中ctDNA的检测方法主要基于识别和监测骨髓瘤特异性免疫球蛋白重排或遗传改变，MM衍生的cfDNA与匹配的BM样本之间的拷贝数变异(CNV)和克隆体细胞突变高度一致。ctDNA浓度与疾病状态相关，且ctDNA水平在意义未明单克隆免疫球蛋白血症(MGUS)、冒烟型MM(SMM)、新诊断MM(NDMM)、复发性MM和治疗后MM患者中存在显著差异。

此外，在对诱导治疗或自体干细胞移植(ASCT)治疗有反应的MM患者中，可以观察到肿瘤特异性cfDNA水平显著下降，并且较长的 cfDNA片段频率增加与较好的治疗反应相关。但如Vrabel等所述，由于M蛋白和cfDNA的半衰期不同，两种生物标志物水平的相关性分析未显示出显著结果，这与Biancon等的研究结果一致。然而，最近一项通过ddPCR和NGS在MM中检测cfDNA的研究表明，cfDNA与M蛋白具有良好的相关性。由于样本量有限和不同研究使用不同panel，目前还未明确如何最好地结合这两种生物标志物进行评估，并且M蛋白检测中更敏感的方法也已开发出来。一项应用于NDMM的多因素cox分析显示，转录调控和DNA修复通路中的ctDNA突变是PFS的独立预测因子。通过低通全基因组测序(LPWGS)检测复发/难治性 MM(RRMM)患者在接受elotuzumab、泊马度胺、硼替佐米和地塞米松联合治疗时的cfDNA发现，基线和两个疗程后的高ctDNA水平(cfDNA中肿瘤比例≥10%)是PFS较差的独立危险因素。另一项应用超深度靶向扩增子测序(TAS)进行血清ctDNA基因分型的研究表明，在一线硼替佐米治疗失败后，接受卡非佐米、沙利度胺和地塞米松(KTd)治疗的适合移植的NDMM患者中，RAS/RAF和DDR的ctDNA突变较高是MM复发相关危险因素。在接受伊沙佐米、来那度胺和地塞米松治疗的RRMM中，通过靶向捕获测序，KRAS和TP53的ctDNA突变可强有力地预测较差的PFS，比BM浆细胞突变更有效。此外，还建立了包括ctDNA突变数和血浆DNA水平在内的预后指数(ctRRMM-PI)，将患者分为3类，2年PFS率存在显著差异。

除此之外，MM ctDNA应用的另一个热点为MRD监测。一项针对接受二线治疗的MM患者的初步研究证实，血浆样本IGH基因重排测序cfDNA检测与配对BM样本的多参数流式细胞术(MFC)检测在MRD分析中完全一致。但另一项对配对血液和BM样本中所有克隆免疫球蛋白基因重排(IGH、IGK、IGL)进行测序以评估MM MRD的比较研究表明，cfDNA和BM浆细胞DNA之间没有相关性(一致性仅为49%)。另一项最近的研究纳入新诊断浆细胞骨髓瘤(PCM)患者，应用低覆盖率全基因组测序(LC-WGS)定量CNV，结论是cfDNA-CNV的动态变化有助于预测预后，并且在治疗期间的MRD检测中比二代流式细胞术(NGFC)更准确和敏感。通过使用靶向深度测序和 ddPCR对髓外MM患者进行体细胞突变检测和监测，血浆ctDNA和 BM穿刺与时间匹配的髓外浆细胞瘤活检的一致性比较显示ctDNA的结果非常理想。综上所述，使用ctDNA进行MM MRD评估是有希望的，尽管合适的检测方法和时间仍需要验证。此外，MM中ctDNA的持续存在是否可以解释骨髓MRD阳性仍然不确定，还需要进一步的研究和验证。

2.3.白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)等

2.3.1.急性髓性白血病(AML)和MDS

由于骨髓采样是白血病疾病状态评估的常规且相对可靠的手段，因此对ctDNA的研究并不像在淋巴瘤和骨髓瘤中那样多，但ctDNA的无创特性可能有助于提高患者对疾病监测的依从性。此外，AML和MDS患者中诊断性BM DNA和匹配的血浆ctDNA谱具有良好相关性，表明ctDNA可作为骨髓评估这一金标准的补充工具。目前，ctDNA正在研究用于白血病和MDS患者的治疗反应评估、预后预测和MRD监测，虽然大多数研究仅限于小样本量，但预计将在更大的队列中进一步证实。

血浆cfDNA 5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)特征可以作为AML的诊断和预测标志物，具有令人满意的灵敏度和准确性。另一项在AML cfDNA中进行5hmC谱分析的最新研究可以根据H3K4me3(启动子中的活性组蛋白标记)区域的5hmC水平，可有效将患者分为三种不同的亚型，表现出明显不同的白血病负荷和OS。AML和MDS患者基线时ctDNA平均水平与匹配的BM原始细胞非常一致，治疗后可检测到ctDNA与较差的PFS和OS相关。一种追踪NPM1和IDH2 ctDNA突变的机制模型显示出对原始细胞清除和复发风险的可预测性。课件使用ctDNA进行MRD监测似乎很有前景。最近一项研究收集50例AML患者的连续BM和匹配血浆样本，用于白血病特异性突变的NGS检测，结果显示BM DNA和ctDNA之间的一致性高达92.8%，进一步的研究结果表明，三个治疗周期后清除ctDNA或实现超过3个对数减少的患者与ctDNA持续阴性的患者具有相似的 PFS改善。另一项应用cfDNA中的5hmC特征检测AML MRD的研究也显示出高灵敏度，可用于预测无复发生存期。与基于MFC的MRD检测结果相比，基于ctDNA的残留疾病检测可提前近4个月。这些研究表明，序列ctDNA评估可以作为MDS和AML中BM MRD监测的补充和替代方法，特别是对于常规BM MRD检测中没有可追踪基因标记的患者，或者当传统方法如MFC或细胞遗传学显示阴性结果时。但还需要更多有足够统计学效力的前瞻性随机对照研究来实际指导治疗的临床决策。

2.3.2.急性淋巴细胞白血病(ALL)

ctDNA在ALL中的应用研究似乎少于AML。MRD监测显示，治疗前与诱导治疗后cfDNA浓度的高比值评分可以强烈预测高危ALL患者的不良预后。ctDNA最有吸引力的应用在于评估髓外复发和CNS受累，其中白血病克隆很少能通过常规BM取样捕获。

2.3.3.其他白血病

CtDNA在慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中容易检测到，并且在治疗后不同疾病之间有平行变化。连续ctDNA监测可以敏感地帮助跟踪克隆动态，并识别与Richter综合征(RS)相关的基因组变化。在最近的一项研究中，基于ctDNA和基于流式细胞术的 MRD监测显示，在使用奥妥珠单抗、阿可替尼和维奈克拉治疗的CLL患者中，其结果高度一致。应用ddPCR鉴定cfDNA/ctDNA上的MYD88突变对有症状的华氏巨球蛋白血症（WM）和IgM MGUS或冒烟型WM患者高度敏感（这些患者具有不同水平的肿瘤负荷）。

3.总结和未来的考虑

当前状态下的ctDNA检测对于血液系统恶性肿瘤患者，特别是侵袭性淋巴瘤和MM患者，是一种很有希望的组织活检或BM采样补充手段，这种便捷、无创的采样方式无疑使患者获益，新出现的数据也显示出tDNA在疾病诊断、治疗、监测和进展过程中的效用。淋巴瘤是一组极具异质性的疾病，在组织活检和影像学评估方面存在很大局限性，因此ctDNA在DLBCL和HL中的研究最多，其在免疫治疗和靶向治疗领域的应用越来越受到关注。骨髓瘤的ctDNA分析也显示出良好的结果，其研究数量仅次于淋巴瘤；其在早期干预和MRD监测中的应用值得关注，因为从潜在疾病到症状性MM和耐药性的进展可能相当棘手。对于白血病等疾病，还需要更多的尝试和证据来解读。

然而，尽管已经发表了许多关于ctDNA的病例报告、临床观察研究和干预研究，但应用的不同技术和选择的不同治疗策略使得协调困难，目前关于ctDNA应用的建议也主要讨论实体瘤。目前仍存在许多问题有待解决。首先，需要可靠的、周转时间和成本更少的测序技术，以及增强疾病筛查和MRD监测的敏感性和特异性。其次，还需要验证其在分子分型和分类中的有效性，以确定其检测是否能够帮助指导临床干预，包括基于ctDNA结果指导早期治疗和靶向治疗选择。第三，在MRD监测中应用ctDNA检测时，需要验证体液的最佳样本量和最合适的采样时间点。此外还必须明确的是，对ctDNA定义的MRD阳性患者进行积极干预是否可以改变生存期和减小副作用，以及对MRD阴性患者不进行干预是否没有风险。对于临床应用，通过前瞻性研究（特别是多中心研究）规范和优化 ctDNA分析仍然非常需要，可用于更新治疗策略和修改监测计划。对于未来的临床管理，建立以ctDNA为指导的综合治疗模式，及时、个体化地调整治疗方案，同时进行治疗前风险分层、疗效监测和治疗后监测，是非常有前景的。

实践点

•连续和重复ctDNA监测为方便和非侵入性的采样方式，具有可行性。此外，理论上，ctDNA检测包括从所有疾病部位脱落的分子，从而克服影像学扫描和组织/BM活检的局限性。

•循环中的ctDNA水平可反映肿瘤负荷以及其在恶性细胞内的释放和清除率。由于相对较高的ctDNA浓度和肿瘤特异性遗传和表观遗传异常的高负荷，许多血液系统恶性肿瘤非常适合ctDNA检测。

•应根据所关注的科学问题或需要解决的临床问题，精心设计样本采集和处理。应遵循经过验证的标准操作程序。目前 ctDNA的检测方法主要有dPCR和NGS。

•ctDNA的应用可分为两大类：定性评估和定量。大多数研究都集中在风险分层、反应评估和MRD评估上，特别是 DLBCL、HL、MM和AML。

后续研究议程

•标准化样品处理、储存、提取、定量的整个流程，确保 ctDNA的质量和数量。

•进一步优化检测技术，以减少时间和成本，提高灵敏度和特异性。

•需要前瞻性研究，特别是多中心研究，以帮助优化ctDNA分析的风险分层、反应评估和MRD评估。也就是说，应该能够回答什么是最佳的ctDNA监测计划，以及结果是否足以帮助指导有意义的干预措施，例如对持续 ctDNA阳性的患者进行更强化的治疗，或者对持续检测不到 ctDNA的患者采取“等待和观察”策略。

•进一步开展ctDNA在分子分类、耐药检测、靶向/细胞治疗选择和监测方面的应用研究。

参考文献

Jun-Ying Li et al., Blood Reviews, https://doi.org/10.1016/j.blre.2024.101237