肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，也是世界范围内癌症相关死亡的主要原因，在早期检测方面提出了重大挑战。传统的诊断方法，如超声、CT和MRI，往往对早期HCC缺乏敏感性，而活检则存在风险和不适。甲胎蛋白（AFP）是一种常用的血清学标志物，在早期HCC中缺乏令人满意的敏感性。

检测循环肿瘤DNA （ctDNA）中癌症特异性DNA甲基化标记物目前被认为是早期检测的首选方法，但该方法存在丰度低和技术复杂性等局限性，这阻碍了其在早期癌症检测中的有效性。外周血单个核细胞（PBMCs）提供了稳定而丰富的DNA来源，可能携带早期HCC的甲基化特征。

近日，杂志communications medicine上发表了一篇题为“Clinical validation of peripheral blood mononuclear cell DNA methylation markers for accurate early detection of hepatocellular carcinoma in Asian patients”的文章。文章表明，将M4评分（基于MAP1LC3B2、NBPF3、RNMTL1P1和STAP1四个基因甲基化水平的评分）与现有的诊断工具（如AFP）相结合，可显著提高早期HCC的诊断敏感性。M4 + AFP在A期的敏感度为88.2%，在所有阶段的敏感度高达95.7%。这些结果强调了PBMC甲基化标志物与当前血清学和血浆标志物结合的潜力，为早期HCC提供了更全面、更有效的诊断方法。

图片来源：communications medicine

主要内容

不同HCC分期基因特异性甲基化谱的比较分析

作者对训练队列中下列基因的中位数甲基化水平进行了受试者操作特征（ROC）分析，以确定每个基因对HCC的鉴别能力：AHNAK 、STAP1 、NBPF3、RNMTL1P1、VMP1、GLRX2、MAP1LC3B2以及cg09435170基因。结果显示，STAP1、RNMTL1P1、GLRX2、NBPF3和MAP1LC3B2在HCC所有阶段都显示出显著差异。VMP1、cg09435170、AHNAK分别在HCC某分期有显著差异 。

在验证队列中，NBPF3在高特异性下，对所有HCC分期中敏感性最高；RNMTL1P1也表现出显著的敏感性，尤其是在早期，但其特异性略低于NBPF3。STAP1、AHNAK和GLRX有高特异性，但在HCC分期中表现出较低的敏感性。其余基因VMP、MAP1LC3B2和cg09435170的特异性和敏感性因HCC分期不同而不同（如下表）。这种基因特异性分析表明，单基因的敏感性是不够的，应该开发一种组合模型。

在验证队列中不同疾病阶段所选基因的性能指标。

图片来源：communications medicine

基因评分的优化以增强HCC分期的区分性能

作者开发了一个HCC早期检测和分期的方法，包括所有8个基因，称为m8评分。结果显示，使用M8评分，对照组与CHB之间无显著差异，而对照组与癌症分期（A期至D期）之间的差异显著，且随着癌症分期的进展，显著性水平的增加（下图A、B）。

作者将M8中的四个重要分类因子（NBPF3、RNMTL1P1、MAP1LC3B2和STAP1）来创建M4评分，并比较了M8和M4评分的表现，并建立100%特异性和最高灵敏度的阈值（图B）。结果显示，在验证队列中，M8和M4评分在对照组中均表现出100%特异性，且M4评分普遍优于M8。

甲基化评分的ROC分析。

图片来源：communications medicine

AFP及其与epiLiver、M8和M4评分的整合

作者评估了PBMC M4和M8评分和AFP与epiLiver的联用，是否提高了HCC检测的敏感性。总体而言，PBMC M评分与epiLiver和AFP的联用显著提高了所有HCC分期的敏感性，同时保持了高特异性，特别是在CHB患者中。在各种组合中，M4-epiLiver+AFP和M8-epiLiver+AFP在HCC晚期表现出最高的敏感性，M4 +AFP在早期高度敏感（如下表）。总的来说，将M4或M8评分与epiLiver和AFP标志物或两者结合，可显著提高HCC的诊断，提高疾病早期和HCC所有阶段的检测能力。

M评分和M-ctDNA综合评分的性能指标。

图片来源：communications medicine

M4和M8评分在HCC

与乳腺癌和前列腺癌比较中的特异性

为了验证M4和M8评分检测HCC的特异性，作者将M4和M8评分应用于来自前列腺癌和乳腺癌患者的PBMC的DNA甲基化数据。结果表明，虽然AHNAK、STAP1和cg09435170位点在乳腺癌（BrCa）和对照组之间显示出显著的甲基化差异，但差异不明显。其他检查的位点没有达到统计学意义。前列腺癌中的AHNAK、STAP1、RNMTL1P1、VMP1和MAP1LC3B2，在与健康对照个体比较时，没有发现统计学意义。

总结与讨论

作者评估了PBMC衍生的甲基化标志物在HCC中的诊断潜力。M8和M4评分与epiLiver和AFP的结合可显著提高早期HCC的诊断敏感性。M4+epiLiver评分在A期HCC的敏感性为79.4%，而M4联合AFP在所有阶段的敏感性提高到88.2-95.7%。结果突出了结合cfDNA甲基化和PBMC DNA甲基化的诊断优势。通过对每个生物标志物集保持100%的高特异性阈值，确保诊断方法的稳健性和可靠性的同时提高了灵敏度。

使用白细胞而非cfDNA的明显优势在于，血浆中（cfDNA）极其稀缺，量化白细胞DNA中DNA甲基化面临更低的技术挑战。研究的局限性在于参与者的数量相对较少，可能会影响结果的准确性和可靠性。此外，组间的年龄差异以及该研究仅在孟加拉国进行，可能会限制对其他人群的适用性。在更大的异质队列中对已确定的甲基化标记进行更广泛的验证是必要的。