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Nature Protocols | 张毅团队开发有效可重复的染色体外环状DNA纯化方法

时间：2022-12-25 15:01:07 热度：37.1℃ 作者：网络

染色体外环状DNA (Extrachromosomal circular DNA, eccDNA)在半个多世纪前被发现。然而，其生物成因和功能的研究才刚刚开始。阻碍我们理解eccDNA的一个障碍是很难从细胞中获得纯的eccDNA。目前的eccDNA纯化方法主要依赖于碱法裂解得到粗环后，用外切酶消化来消耗线性DNA。然而，由于eccDNA的低丰度和异质大小，目前的纯化方法不能有效地获得纯的eccDNA。

2022年12月14日，霍华德休斯医学研究所张毅课题组在Nature Protocols杂志在线发表题为“Purification, full-length sequencing and genomic origin mapping of eccDNA”的研究论文，该研究描述了一个新的三步eccDNA纯化(three-step eccDNA purification，3SEP)程序，该程序增加了一个步骤来恢复环状DNA，而不是从外切酶消化中逃脱的线性DNA，因此3SEP导致高纯度和可重复性的eccDNA制备。

此外，该研究开发了一种结合滚圈扩增和纳米孔测序的全长eccDNA测序技术。因此，开发的全长的eccDNA调用者(full-length eccDNA caller，Flec)来调用包含在去分支滚圈扩增产物中的多个串联副本的一致序列，并将一致序列映射到其基因组起源。总的来说，这种方案将促进eccDNA的鉴定和表征，并具有诊断和临床应用的潜力。

自1964年首次描述起，在几乎所有细胞系、组织和器官中都发现了染色体外环状DNA (eccDNA)。完整的eccDNA纯化方法对于识别eccDNA的基因组起源、了解其生物起源和生物学功能(包括其强大的免疫刺激活性)至关重要。然而，eccDNA的大小异质性(从数百个碱基对到数十万个碱基对不等)和相对于线性染色体的低丰度使得获得纯eccDNA极其困难。因此，获得纯eccDNA的成功策略需要结合不同的原理来分离环状DNA和线性DNA。

到目前为止，Hirt提取，碱性裂解，外切酶消化和浮力密度已被用于纯化eccDNA。通常，两轮富集用于获得eccDNA。粗DNA环首先从生物样本中提取，然后通过Hirt或碱性裂解将其相关蛋白沉淀并去除。然后，粗环状DNA中的线性污染物DNA通过浮力密度分离，或用外切酶如ATP依赖的质粒安全DNase (PS DNase)、外切酶V (RecBCD)或外切酶III进行消化。在这些方法中，Circle-seq(最初由Dutta的实验室开发，然后由Regenberg的实验室命名)变得流行起来，并且可以获得经过轻微修改的详细协议。简单地说，在Circle-seq中，粗环状DNA通过碱性裂解分离，然后外切酶PS DNase用于消化线性污染DNA。

然而，在使用外切酶处理时，必须采取两项预防措施。首先，必须检查所使用的外切酶的特异性和有效性，因为外切酶中的微量内切酶活性会导致eccDNA丢失，特别是考虑到在Circle-seq中使用了延长的多轮外切酶消化;其次，核酸外切酶切口可被内源性线性DNA末端的不同阻断物取消，如突出的末端、某些异常和受损的核苷酸、交联、特殊结构等，甚至被核酸酶消化产物所抑制。因此，对于碱法裂解得到的粗环状DNA，仅用外切酶消化可能不足以获得纯的eccDNA，直接显微成像显示。虽然Hirt、碱性裂解甚至核酸外切酶处理得到的粗环状DNA都可以用氯化铯-溴化乙矾梯度超离心机进一步纯化，但由于其费力的性质，这种方法不能满足大多数研究的需要。

该研究描述了一种稳健的三步eccDNA纯化(3SEP)技术，其中包括另一个阳性选择步骤，在改良的碱性裂解和PS DNase消化后进一步富集eccDNA。在第一步中，粗DNA环被缓冲(pH值11.8)的碱性裂解提取，这种条件比传统的0.2 M氢氧化钠造成更少的环状DNA损失。在第二步中，通过atp依赖性PS DNase处理粗环状DNA产物中的线性DNA减少;同时，环形线粒体DNA可以通过8 bp切割器PacI的限制性消化线性化，使这种方法兼容从全细胞中提取eccDNA。

最后，也是最重要的是，研究人员用溶液A进一步积极选择eccDNA，这是一种专有试剂，允许选择性结合并通过硅珠回收环状DNA，同时将逃脱PS DNase消化的线性DNA留在溶液中。