本研究旨在明确癌症病理诊断与NGS检测成功率的相关性。回顾实体瘤的临床NGS检测结果，基于肿瘤类型和伴随因素分析成功率。在683个样本中，533个（78.0%）检测成功。卵巢癌的成功率为91.8%，非小细胞肺癌为87.5%，结直肠腺癌为82.0%，黑色素瘤为78.3%，乳腺癌为75.9%，胰腺腺癌为64.7%。在检测成功的样本中，与其他肿瘤类型相比，胰腺腺癌的中位肿瘤细胞占比以及体细胞RAS和TP53突变丰度最低。在胰腺腺癌中，细胞学样本的成功率为33.3%（5/15）；在肺癌中，细胞学样本的成功率为93.3%（14/15）。在胰腺腺癌中，转移部位组织的成功率高于原发部位组织；在结直肠腺癌和黑色素瘤中则相反。癌症NGS检测的成功率取决于病理诊断、组织部位和诊断程序。了解哪些样本分子检测失败的风险较高，可能有助于病理学家和临床管理团队优化组织采集和使用。

研究背景

二代测序（NGS）已被确立为晚期癌症患者的标准分子检测。临床NGS检测的效用已在非小细胞肺癌中得到最广泛的验证，可以检测一系列可靶向治疗的致癌驱动基因突变和基因融合。随着更多靶向疗法的出现，NGS检测已在临床上用于各种其他实体瘤检测可靶向治疗的基因变异。

成功的癌症NGS检测需要从病理实验室获取诊断组织，然后进行DNA提取，文库制备，测序，信息学分析和临床解读。先前的文献表明，NGS失败主要发生在分析前阶段，原因是组织不足。据报道，NGS检测在肺癌中的总体成功率高达80%至90%，而其他实体瘤中的成功率尚不明确。本文报告了单中心临床NGS在多种实体瘤类型中的成功率，并分析了导致样本不合格的因素。

研究结果

回顾性分析了布莱根妇女医院4个月间的连续临床NGS检测结果。记录相关因素，包括病理诊断、肿瘤细胞占比、样本类型和样本部位。纳入了683个样本，包括胰腺腺癌（n = 162），非小细胞肺癌（n = 160），浸润性乳腺癌（n = 141），结直肠腺癌（n = 111），黑色素瘤（n = 60）和卵巢癌（n = 49）。

在683个样本中，533个（78.0%）成功进行了NGS检测。在检测失败的150个样本中，97个（64.7%）玻片审查失败，肿瘤细胞占比低于20%或没有组织；34个（22.7%）DNA提取失败，DNA提取量低于50 ng；10个（6.7%）测序失败，平均测序深度低于50×；9个（6.0%）临床解读失败。未通过玻片审查的肿瘤和检测成功的肿瘤的代表性组织学图像如图1所示。

图1. 病理样本代表性H&E图像。（左）组织学审查认为不合格样本；（中）肿瘤细胞占比20%-30%，检测成功样本；（右）肿瘤细胞占比≥50%，检测成功样本。测序显示KRAS和TP53突变丰度如下：A，胰腺腺癌（中：KRAS p.G12V 11%和TP53 p.V216M 18%；右：KRAS p.G12D 40%和TP53 p.I195F 43%）（×10）。B，非小细胞肺癌（中：KRAS p.G12V 17%和TP53 p.V157F 15%；右：TP53 p.Y236D 58%）（×20）。C， 结直肠腺癌（中：KRAS p.G12D 11%和TP53 p.S260_L265dup 14%；右：KRAS p.A146T 86%和TP53 p.R175H 69%）（×20）。

基于病理诊断的样本成功率各异（图2）。卵巢癌中，45/49个（91.8%）样本检测成功；而在胰腺腺癌中，成功率仅为103/162（63.6%）。非小细胞肺癌（87.5%）、结直肠腺癌（82.0%）、黑色素瘤（78.3%）和乳腺癌（75.9%）的成功率中等。

图2. 基于病理诊断的检测成功率

59个胰腺腺癌样本检测失败，原因包括：45个（76.3%）肿瘤细胞含量低，13个（28.9%）DNA提取量低于50 ng。DNA提取量低的原因最可能是组织量少。13个DNA不足样本中，11个为活检样本，另外2个为细胞学样本。没有手术切除样本DNA提取失败。1个胰腺腺癌样本临床解读失败，没有体细胞突变和拷贝数变异，与肿瘤取样较差一致。

在NGS检测成功的样本中，与肺癌（中位50%）、结直肠腺癌（中位50%）、乳腺癌（中位60%）、卵巢癌（中位60%）和黑色素瘤（中位80%）相比，胰腺腺癌肿瘤细胞占比最低（中位35%）（胰腺vs其他，Mann-Whitney P< 0.001）。作为肿瘤细胞占比的分子相关性，评估致病性RAS通路突变（KRAS，NRAS，HRAS或BRAF）和TP53突变丰度。胰腺腺癌的中位RAS突变丰度为22.8%，低于肺癌（30.0%）、乳腺癌（31.7%）、结直肠腺癌（31.2%）、黑色素瘤（33.9%）和卵巢癌（39.2%）（胰腺vs其他，Mann-Whitney P = 0.002）（图3A）。胰腺腺癌的中位TP53突变丰度为25.0%，低于肺癌（35.5%）、乳腺癌（49.6%）、结直肠腺癌（39.7%）、黑色素瘤（62.4%）和卵巢癌（41.2%）（胰腺vs其他，Mann-Whitney P < 0.001）（图3B）。

图3. 基于肿瘤类型的突变丰度散点图。每个标记代表1个突变。橙色水平线代表每种肿瘤类型的中位值。A，RAS通路突变。B，TP53突变。

为了进一步比较不同肿瘤类型的测序质量，分析了NGS检测成功样本的3个质量指标：去重后的平均测序深度，30x测序深度占比以及重复序列占比。整个队列的平均（SD）测序深度为258（68），平均（SD）30x测序深度占比为97.9%（1.6%），平均（SD）重复序列占比为41.2%（8.8%）。不同肿瘤类型的平均测序深度（ANOVA P = 0.20）和30x测序深度占比（ANOVA P = 0.70）没有差异。各组的重复序列占比差异有统计学意义（ANOVA P = 0.02）。事后分析显示肺癌（平均39.4%）和结直肠癌（平均43.0%）存在差异（Tukey’s HSD P = 0.03）。

48个细胞学样本中，28个（58.3%）成功完成NGS；464个活检样本中，351个（75.6%）成功；171个手术样本中，154个（90.1%）成功（Fisher exact P < 0.001）。成功率因病理诊断而异（图4A）。胰腺腺癌中，细胞学样本的成功率为33.3%（5/15）；肺癌中，细胞学样本的成功率为93.3%（14/15）。分析每个诊断组，只有胰腺腺癌在基于样本类型的NGS成功率方面表现出显著差异（P = 0.005）。尽管细胞学样本的成功率最低，但与成功的活检样本（平均测序深度，263；平均30x测序深度占比，98.1%；平均重复序列占比，40.2%）和成功的手术样本（平均测序深度，240；平均30x测序深度占比，97.4%；平均重复序列占比，44.1%）相比，成功的细胞学样本与最高的测序质量指标（平均测序深度，298；平均30x测序深度占比，98.4%；平均重复序列占比，38.1%）相关。基于程序类型的每个质量指标的比较显示具有统计学意义（ANOVA P < 0.001）。

图4. 影响癌症NGS检测成功率的因素。A，样本类型。B，样本部位。

在整个队列中，原发部位与转移部位样本的比较显示没有差异。在318个原发部位样本中，243个（76.4%）成功完成NGS；在365个转移部位样本中，290个（79.5%）成功完成NGS（Fisher exact P = 0.36）。在各个诊断组中，原发部位与转移部位样本的成功率存在差异（图4B）。在胰腺腺癌中，原发部位样本的成功率为52.1%（49/94），转移部位样本为79.4%（54/68）（P<0.001）。在结直肠腺癌中，原发部位样本的成功率为90.2%（55/61），转移部位样本为72.0%（36/50）（P = 0.02）。在黑色素瘤中，原发部位样本的成功率为92.6%（25/27），转移部位样本为66.7%（22/33）（P = 0.03）。

讨 论

在过去十年中，随着靶向治疗的可及性增加，癌症分子检测的临床需求迅速扩大。靶向治疗相对于传统化疗的益处在非小细胞肺癌中已得到充分证实。本研究中包含的其他肿瘤类型共识指南建议进行靶向治疗相关变异体细胞分子检测，包括结直肠腺癌检测KRAS、NRAS、BRAF和微卫星不稳定性，黑色素瘤检测BRAF，乳腺癌检测PIK3CA，乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌检测BRCA1和BRCA2。

样本采集、组织学审查和最佳组织处理这些分析前因素对于分子检测至关重要。目前关于样本质量和NGS检测影响的文献主要集中在肺癌，已经制定了组织和细胞病理学样本优化使用方案。评估NGS检测在其他病理诊断中的广泛成功率的文章有限。

据我们所知，本研究首次表明了多种实体瘤中临床NGS检测成功率的差异。在本研究队列中，卵巢癌成功进行NGS检测的可能性很高，而胰腺腺癌的成功率较低。肿瘤类型也会影响其他预测因素。胰腺腺癌细胞病理学样本与成功率低有关。胰腺腺癌原发部位样本的成功率低于转移部位样本，而结直肠腺癌和黑色素瘤则相反。

解剖病理学家应该发现这些结果是直观的。由于结缔组织增生和慢性胰腺炎背景，原发性胰腺肿瘤的肿瘤细胞/非肿瘤细胞比例通常较低。这些特征在转移性病变中可能不太显著。原发性胰腺腺癌也很难在解剖学上获得。内窥镜超声引导的活检通常是原发性胰腺腺癌的第一个诊断程序，在技术上具有挑战性，由此产生的活检或细胞学样本可能存在非肿瘤组织污染，细胞较少。转移性胰腺腺癌可能更容易通过其他诊断程序获得，因此肿瘤产量更高。相比之下，卵巢癌通常表现出汇合生长模式，通常通过切除术或减瘤术诊断，因此产生的诊断材料更多。对于结直肠癌和黑色素瘤，与转移部位相比，通过内窥镜或外部检查在原发部位取样可能更容易。

一个意想不到的发现是，对于成功进行NGS检测的患者，细胞学样本的测序质量指标最佳，包括平均测序深度更高，重复序列占比更低，其次是活检样本。手术样本的测序质量指标最差，尽管结果令人满意可进行解读。我们推测，细胞病理学样本可能受益于手术时细胞材料的快速固定。相比之下，手术样本需要更复杂的处理。潜在的组织固定延迟和福尔马林穿透较大组织的时间更长可能导致DNA降解。应谨慎解释这些结果，因为细胞学样本显示出更高的失败率，且只有成功的样本包括在分析中。总体而言，研究结果支持在适当的分析前考虑因素到位的情况下使用细胞学样本进行分子检测。

记录肿瘤类型与NGS成功率的相关性可能有助于改善病理学和患者管理团队的临床管理实践。解剖病理学家可能格外小心对待更容易失败的样本，并实施方案使组织最优化用于分子检测。分子病理学家可以寻找机会开发具有更高分析灵敏度的检测。在失败率高于平常的情况下，患者管理团队可以尝试获得超出常规诊断所需的组织。对个体化医疗中NGS成功率的了解可能使受益于分子检测的患者的临床管理最优化。

参考文献：

Latham K, Dong F. The success rates of clinical cancer next-generation sequencing based on pathologic diagnosis: Experience from a single academic laboratory. Am J Clin Pathol. 2023 Aug 6:aqad092. doi: 10.1093/ajcp/aqad092. Epub ahead of print. PMID: 37543867.